2.1 選擇合適的外植體

  正確選擇外植體是組培取得成功的前提，一般一年生或者二年生的草本植物比多年生的木本植物帶菌少;幼嫩的材料比老的材料帶菌少;溫室培養(yǎng)的植物比田間生長的植物帶菌少;不帶泥土的材料比帶土的材料帶菌少。避免在陰雨天采集外植體，強(qiáng)烈陽光可滅殺一些真菌和細(xì)菌。對于大多數(shù)植物來說，莖尖組織生長速度快、遺傳性狀穩(wěn)定，病毒感染率低，所以莖尖組織是培育無毒苗的很佳外植體。但是莖尖數(shù)量較少，因此生產(chǎn)中植物中上部的莖段組織也是較好的外植體。不同植物由于本身不同部位的生長特性不同，宜采集容易消毒和滅菌的部位，以降低污染帶菌率。

  2.2 外植體消毒

  外植體可能帶有外生菌和內(nèi)生菌，必須經(jīng)徹底消毒才能接種。外生菌可用表面消毒的方法滅菌，一般情況采用的消毒法：用75%酒精浸泡幾秒至1 min后，再迅速浸入0.1%升汞溶液中5～10 min。一些難消毒的外植體要采用特殊的措施，如表面帶有較多絨毛的外植體可用真空減壓消毒，真空減壓抽走絨毛下的空氣，讓消毒液更容易浸入，以增強(qiáng)滅菌效果。使用混合的消毒液或多次消毒的方法，也可增強(qiáng)滅菌效果。對于內(nèi)生細(xì)菌，表面消毒無法滅菌，可采用分生組織培養(yǎng)或反復(fù)莖尖培養(yǎng)的方法來脫除，也可在培養(yǎng)基中添加抗菌素、降低pH值等方法來預(yù)防和控制內(nèi)生菌的污染。

  2.3 培養(yǎng)基滅菌

  培養(yǎng)基與培養(yǎng)器皿的滅菌大都采用高壓濕熱蒸汽滅菌法以確保滅菌效果完全徹底。滅菌過程中當(dāng)壓力升到0.5 kg/cm2時(shí)，開啟放氣閥將鍋內(nèi)冷空氣排凈，再關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，壓力上升到1.1 kg/cm2、121℃時(shí)，保持15～20 min即可。

  2.4 接種過程嚴(yán)格滅菌

  接種時(shí)工作人員應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范無菌操作，避免人為因素造成染菌。要定期檢查超凈工作臺，定期對過濾器進(jìn)行清洗與更換，避免操作區(qū)域帶菌。內(nèi)部的過濾器每隔一定時(shí)間要檢測操作區(qū)的帶菌量，如果發(fā)現(xiàn)過濾失敗，則要整塊更換。此外還需要測定操作區(qū)的風(fēng)速，通過調(diào)壓旋鈕使操作區(qū)的風(fēng)速達(dá)到無菌操作需要的每分鐘20～30 m。操作人員要做到盡量少帶菌，嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作，接種過程中使用的各種器具都要嚴(yán)格滅菌。接種用的器具要經(jīng)高溫滅菌，每次使用后蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌。在超凈工作臺的操作范圍內(nèi)，不能放入過多的育苗材料，以免擋住氣流。感染雜菌的培養(yǎng)瓶在滅菌處理后才能打開洗滌。脫毒培養(yǎng)所用的顯微鏡不能用高溫高壓滅菌，可用75%酒精擦洗顯微鏡表面，再放在操作臺上用紫外燈殺菌。

  2.5 環(huán)境消毒

  不清潔的環(huán)境使培養(yǎng)的污染率明顯增加，因此接種室與培養(yǎng)室應(yīng)定期凈化與消毒，接種前接種室和培養(yǎng)室應(yīng)用紫外燈照射消毒30 min以上或用2%來蘇水消毒，定期對接種室和培養(yǎng)室熏蒸或噴霧消毒。甲醛和高錳酸鉀熏蒸消毒效果較好，但是對人體存在一定的傷害，通常每年熏蒸2、3次。紫外線與臭氧對環(huán)境消毒效果好，且使用靈活簡便，對人體的傷害較小。夏季、高溫高濕的環(huán)境污染率較高，要求培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%以下。

  隨著組培技術(shù)的快速發(fā)展，植物組培育苗的應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣闊。在育苗過程中控制或降低污染是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，既要保證控制污染的效果良好，又要力求外植體不受損傷或輕微損傷不影響生長。因此控制污染、建立潔凈培養(yǎng)環(huán)境、無菌的植株系統(tǒng)是組培育苗的努力方向。