甜菜是我國重要的糖料作物之一，在北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。然而隨著甜菜機械化作業(yè)程度的不斷提高，特別是大規(guī)模集約化生產(chǎn)的不斷推進，甜菜生產(chǎn)中病蟲草害越來越重，通過人工防治病蟲害及除草成本越來越高。因此，順應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展方向、結(jié)合甜菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求開展甜菜抗性轉(zhuǎn)基因育種研究可加速育種進程，也是今后甜菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然選擇。

  部分植物基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)相對成熟，但甜菜轉(zhuǎn)基因育成品種一直未見報道。甜菜轉(zhuǎn)基因品種未能產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用是由多種原因造成的，其中甜菜很難建立起高效的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系是其中一個重要的限制因素。本研究通過對甜菜雄性不育系的多種外植體進行再生培養(yǎng)，研究分析影響甜菜外植體再生的因素，建立并優(yōu)化甜菜植株再生體系，為甜菜轉(zhuǎn)基因開展前期基礎(chǔ)性工作。

  1 材料與方法

  1.1 供試材料

  供試材料為甜菜雄性不育系32467，由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所提供。

  1.2 方法

  1.2.1 無菌苗培養(yǎng) 將磨掉花萼完整的甜菜種球，用百菌清(霜霉煙劑)密閉熏蒸24 h后，在超凈工作臺中移至滅過菌的三角瓶中，隨后用75%乙醇消毒2 min，無菌水漂洗3次;再用0.1%的氯化汞處理20 min，無菌水漂洗3次;后將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基上，置于組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 23 ℃。

  1.2.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的選擇 在超凈工作臺上，將無菌苗置于無菌培養(yǎng)皿中，將無菌苗的葉柄切成1 cm左右的小段，隨后將葉柄接種于含有不同濃度生長調(diào)節(jié)劑的分化培養(yǎng)基(表1)中進行分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，以篩選出誘導(dǎo)葉柄分化成不定芽的適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基接種葉柄120個。

  表1 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基正交設(shè)計

  1.2.3 高誘導(dǎo)率外植體的篩選 在超凈工作臺中，將無菌苗的下胚軸、葉柄、叢生芽塊均切成長約1 cm的小段，分別置于篩選出的佳不定芽誘導(dǎo)率培養(yǎng)基，根據(jù)不同類型外植體誘導(dǎo)率，確定誘導(dǎo)率高的培養(yǎng)基。3種不同類型的外植體均接種120個。

  1.2.4 繼代培養(yǎng)基的選擇 當誘導(dǎo)的叢生芽長到約1 cm時，在超凈工作臺中將叢生芽分切為單苗，接種于繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)(表2)，根據(jù)不同培養(yǎng)基中幼苗生長情況，篩選佳繼代培養(yǎng)基。

  表2 繼代培養(yǎng)基植物激素含量

  1.2.5 生根培養(yǎng)基的選擇 將幼苗叢生芽分切成約1.5 cm長的單株，分別接種于含0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度23 ℃，光照度2 000 lx，光照時間13 h。3周左右即可誘導(dǎo)生根。觀察不同培養(yǎng)基生根情況，根據(jù)生根誘導(dǎo)率，確定佳生根培養(yǎng)基。

  2 結(jié)果與分析

  2.1 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基篩選

  由表3可知，不同激素濃度的培養(yǎng)基誘導(dǎo)甜菜叢生芽再生的效果不同。在16種不同激素濃度的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率高的是14號培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)率達10.3%。因此佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基成分確定為MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT。

  表3 甜菜葉柄在不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率

  2.2 不同外植體再生性比較結(jié)果分析

  將甜菜雄性不育系無菌苗的3種類型外植體，分別接種于篩選出的佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中。由表4可知，葉柄的誘導(dǎo)率高，達10.8%，明顯高于叢生芽塊的4.2%和下胚軸的6.7%。因此確定佳的外植體為葉柄。

  表4 不同類型外植體的誘導(dǎo)率

  2.3 繼代培養(yǎng)基篩選結(jié)果分析

  將生長狀況相似的健壯甜菜雄性不育系叢生芽接種于不同植物激素類型和含量的繼代培養(yǎng)基中，其生長狀況差異較大。由表5可知，添加MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT培養(yǎng)基中叢生芽生長速度快，植株健壯，無玻璃化、褐化等現(xiàn)象出現(xiàn)，但隨著KT含量的增加，叢生芽出現(xiàn)不生長甚至死亡的現(xiàn)象。接種于含有6-BA激素的培養(yǎng)基中的叢生芽陸續(xù)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，且隨著6-BA含量的增加，玻璃化現(xiàn)象更加明顯。因而，確定繼代培養(yǎng)基成分為MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT。

  2.4 生根培養(yǎng)基篩選結(jié)果分析

  將生長健壯的叢生芽接種在含有不同濃度NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，由表6可知，當NAA低濃度時生根誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的升高而增加，NAA濃度為1.2 mg/L時，誘導(dǎo)率高，達到83.33%。然而，隨著NAA濃度的持續(xù)升高，生根誘導(dǎo)率呈現(xiàn)下降的趨勢。因而確定佳生根培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L NAA。

  表5 不同繼代培養(yǎng)基中生長情況

 表6 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根結(jié)果

  3 結(jié)論與討論

  本研究以甜菜雄性不育系32467為材料，對甜菜無菌苗植株再生的各個因素進行研究，建立了甜菜雄性不育系植株再生體系。乙醇和氯化汞消毒之前，先對打磨后的種球進行熏蒸，可明顯降低污染率;誘導(dǎo)叢生芽再生率高的外植體是葉柄;篩選出的優(yōu)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT;篩選出的優(yōu)繼代培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT;篩選出的優(yōu)生根培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L NAA。